Plásmido CRISPR de Activación (m) ALCAM: sc-419076-ACT

Alcam codifica la molécula de adhesión celular de leucocitos activados (ALCAM/CD166), un receptor de la superfamilia de las inmunoglobulinas que media interacciones homofílicas y heterofílicas para regular la adhesión célula–célula, la migración y la organización tisular durante el desarrollo del ratón y la homeostasis en el adulto. ALCAM participa en procesos vinculados a la remodelación del citoesqueleto y a la dinámica de las uniones, influyendo en la integridad epitelial, la guía axonal neuronal y el tráfico de células inmunitarias. A través de su señalización dependiente de la adhesión, ALCAM puede modular vías que controlan la proliferación y la diferenciación, incluidos efectos dependientes del contexto sobre la salida de señalización de MAPK y PI3K-AKT. La desregulación de la expresión de ALCAM se ha asociado con propiedades tipo madre alteradas, invasión y comportamiento metastásico en múltiples modelos de enfermedad, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar la plasticidad fenotípica impulsada por la adhesión.

ALCAM El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Alcam sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ALCAM El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Alcam en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Alcam, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ALCAM. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Alcam y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ALCAM en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ALCAM en células tumorales con expresión de Alcam silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.