Akt3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400028-ACT

AKT3 kodiert die Serin/Threonin-Kinase Akt3, einen PI3K-abhängigen Effektor, der Signale von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen integriert, um Zellüberleben, Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Akt3 ist an der kanonischen PI3K–AKT–mTOR-Signalübertragung beteiligt und steht in Wechselwirkung mit FOXO-, GSK3- und BAD-vermittelten Netzwerken, die Apoptoseresistenz, Proteinsynthese und Zellzyklusprogression prägen. In menschlichen Geweben ist die AKT3-Aktivität insbesondere für die neuronale Entwicklung und zelluläre Stressantworten relevant; eine fehlregulierte Signalgebung wurde in verschiedenen Krankheitskontexten mit veränderter Wachstumskontrolle und einer Umgestaltung onkogener Signalwege in Verbindung gebracht. Eine Modulation der AKT3-Expression ist daher nützlich, um die Dynamik von Signalwegen, Feedback-Regulationen und Zellzustandsübergänge zu untersuchen, die mit proliferativen und metabolischen Phänotypen verknüpft sind.

Akt3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AKT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Akt3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AKT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AKT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Akt3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AKT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Akt3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Akt3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AKT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.