Plasmide CRISPR d'Activation (h) AICAR: sc-404771-ACT

L’ATIC humain code l’enzyme bifonctionnelle 5‑aminoimidazole‑4‑carboxamide ribonucléotide formyltransférase/IMP cyclohydrolase (AICAR), qui catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse de novo des purines conduisant à la production d’inosine monophosphate. Par son rôle dans le transfert de groupements formyle dépendant du métabolisme des unités monocarbonées et dans le maintien des réserves de nucléotides, ATIC soutient la synthèse d’ADN/ARN, la progression du cycle cellulaire et l’homéostasie métabolique. Une perturbation de l’activité d’ATIC peut affecter la capacité proliférative et les réponses au stress de réplication, reliant ainsi la dérégulation de la voie des purines au métabolisme des cellules cancéreuses et, plus largement, à des vulnérabilités métaboliques. Des anomalies héréditaires de cette voie ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et métaboliques, soulignant l’importance d’un contrôle strict de la synthèse des purines.

AICAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATIC sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AICAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATIC dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATIC, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AICAR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATIC natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AICAR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AICAR dans les cellules tumorales présentant une expression de ATIC silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.