AGR3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406892-ACT

Anterior Gradient Protein 3 (AGR3) ist ein Mitglied der humanen Protein-Disulfidisomerase-Familie, das im sekretorischen Weg lokalisiert ist, wo es die oxidative Proteinfaltung und Reifung ausgewählter Zielproteine unterstützt. AGR3 trägt zur Proteostase des endoplasmatischen Retikulums und zu Programmen der epithelialen Differenzierung bei, und seine Expression ist häufig in schleimproduzierenden und sekretorischen Epithelien angereichert. Eine dysregulierte AGR3-Expression wurde bei mehreren epithelialen Malignomen beschrieben und wird im Zusammenhang mit Tumorzellphänotyp, Stressanpassung und Umgestaltung des sekretorischen Weges untersucht. Diese Eigenschaften machen AGR3 zu einem nützlichen Ansatzpunkt, um die ER-Qualitätskontrolle, sekretionsgekoppelte Signalwege und Transkriptionszustände zu untersuchen, die mit der Epithelbiologie assoziiert sind.

AGR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGR3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AGR3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGR3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGR3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AGR3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGR3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AGR3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AGR3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGR3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.