AF-6 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-404503-ACT-2

Il gene umano AFDN codifica la proteina di impalcatura giunzionale AF-6 (afadin), un adattatore multidominio che collega i recettori di adesione della famiglia delle nectine al citoscheletro di actina, organizzando le giunzioni aderenti e mantenendo l’integrità della barriera epiteliale ed endoteliale. AF-6 coordina il rimodellamento del citoscheletro e la polarità cellulare integrando segnali provenienti da piccole GTPasi come Rap1 e Ras, contribuendo alla formazione dei contatti, alla migrazione collettiva e alla meccanotrasduzione nella morfogenesi dei tessuti. Un’alterazione della funzione e della localizzazione di AFDN/AF-6 è stata associata a modifiche dell’adesione cellula-cellula e a un comportamento invasivo nel cancro, e varianti che influenzano la stabilità delle giunzioni sono state implicate in fenotipi neuroevolutivi e vascolari. AFDN è pertanto ampiamente utilizzato in studi di gene editing e di genomica funzionale per indagare l’assemblaggio delle giunzioni, le reti di polarità e il crosstalk di segnalazione ai contatti cellula-cellula in modelli cellulari umani.

AF-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AFDN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AF-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AFDN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AFDN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AF-6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AFDN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AF-6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AF-6 nelle cellule tumorali con espressione di AFDN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.