Plásmido CRISPR de Activación (h2) AF-6: sc-404503-ACT-2

El gen humano AFDN codifica la proteína andamiaje de las uniones AF-6 (afadina), un adaptador multidominio que enlaza los receptores de adhesión de la familia de las nectinas con el citoesqueleto de actina para organizar las uniones adherentes y mantener la integridad de la barrera epitelial y endotelial. AF-6 coordina la remodelación del citoesqueleto y la polaridad celular al integrar señales de pequeñas GTPasas como Rap1 y Ras, contribuyendo a la formación de contactos, la migración colectiva y la mecanotransducción durante la morfogénesis tisular. La desregulación de la función y la localización de AFDN/AF-6 se ha asociado con alteraciones de la adhesión célula–célula y un comportamiento invasivo en cáncer, y se han implicado variantes que afectan la estabilidad de las uniones en fenotipos del neurodesarrollo y vasculares. Por ello, AFDN se utiliza ampliamente en estudios de edición génica y genómica funcional para investigar el ensamblaje de las uniones, las redes de polaridad y el entrecruzamiento de señales en los contactos célula–célula en modelos celulares humanos.

AF-6 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AFDN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AF-6 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AFDN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AFDN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AF-6. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AFDN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AF-6 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AF-6 en células tumorales con expresión de AFDN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.