Plásmido CRISPR de Activación (m) Acid Ceramidase: sc-419216-ACT

El gen murino Asah1 codifica la ceramidasa ácida, una hidrolasa lisosomal que desacetila la ceramida para generar esfingosina y ácidos grasos libres, modulando el equilibrio entre el almacenamiento y el recambio de esfingolípidos. Al regular los reservorios de ceramida y esfingosina, la ceramidasa ácida influye en el tráfico de membranas dependiente de los lisosomas, la autofagia y redes de señalización sensibles al estrés vinculadas a la supervivencia celular y a respuestas inflamatorias. La alteración de la actividad de ASAH1 se asocia con acumulación de esfingolípidos y disfunción lisosomal, conectando esta vía con fenotipos neurodegenerativos y metabólicos sistémicos. Por lo tanto, Asah1 es un nodo clave para estudiar la señalización lipídica centrada en la ceramida y la homeostasis lisosomal en modelos celulares murinos y modelos in vivo.

Acid Ceramidase El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Asah1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Acid Ceramidase El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Asah1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Asah1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Acid Ceramidase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Asah1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Acid Ceramidase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Acid Ceramidase en células tumorales con expresión de Asah1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.