ABCG8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402453-ACT

ABCG8 kodiert einen ATP-bindenden Cassette-(ABC)-Halbtransporter, der mit ABCG5 zu einem Heterodimer assoziiert und so eine funktionelle Sterol-Effluxpumpe an der apikalen Membran von Enterozyten sowie an der kanalikulären Membran von Hepatozyten bildet. Dieser Komplex begrenzt die intestinale Aufnahme und fördert die biliäre Ausscheidung von Nahrungssterolen und prägt dadurch die Ganzkörper-Homöostase von Cholesterin und Phytosterolen über koordinierte Transport- und Lipidverarbeitungswege. Eine Störung der ABCG8-Aktivität beeinträchtigt den Steroltransport und wird mit dysregulierten Sterolprofilen im Plasma sowie mit erblichen Phänotypen der Sterolakkumulation in Verbindung gebracht, einschließlich sitosterolämieähnlicher Erscheinungsbilder. Daher wird ABCG8 umfassend im Kontext der metabolischen Regulation, der Lipidtransportbiologie und der Genotyp-Phänotyp-Zusammenhänge im Sterolstoffwechsel untersucht.

ABCG8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCG8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABCG8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCG8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCG8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABCG8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCG8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABCG8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABCG8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCG8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.