ABCG2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416737-ACT

ABCG2 (ATP-binding cassette Subfamilie G Mitglied 2) ist ein Efflux-Transporter der Plasmamembran, der unter Nutzung der ATP-Hydrolyse ein breites Spektrum endogener Metabolite und Xenobiotika aus der Zelle exportiert. Er wird stark in Barrieregeweben sowie in stammzellähnlichen Zellkompartimenten exprimiert, wo er zum „Side-Population“-Phänotyp beiträgt und die intrazelluläre Anreicherung kleiner Moleküle reguliert. Die ABCG2-Aktivität überschneidet sich mit Entgiftungs- und oxidativem-Stress-assoziierten Prozessen und beeinflusst so die zelluläre Homöostase unter metabolischer und umweltbedingter Belastung. Veränderte ABCG2-Expression oder -Funktion ist mit Unterschieden in der Arzneistoffverteilung (Disposition) verbunden und wurde in der Krebsbiologie sowie im Kontext des Gewebeschutzes untersucht, wo transporter-vermittelter Efflux die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber chemischen Stressoren prägt.

ABCG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ABCG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ABCG2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ABCG2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ABCG2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.