ABCB5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404392-ACT

ABCB5 codifica un trasportatore della famiglia ATP-binding cassette (ABC), implicato nell’efflusso transmembrana ATP-dipendente di piccole molecole e xenobiotici, collegando la sua attività alla detossificazione cellulare e all’omeostasi del trasporto di membrana. Nei tessuti umani, l’espressione di ABCB5 è stata associata a programmi cellulari di tipo staminale e alla regolazione della distribuzione intracellulare dei farmaci, con effetti a valle sulla segnalazione di risposta allo stress, sullo stato di differenziamento e sulle vie di sopravvivenza. Un’espressione deregolata di ABCB5 è stata riportata in molteplici contesti oncologici ed è oggetto di studio per la sua relazione con la plasticità delle cellule tumorali, i fenotipi associati alla chemioresistenza e la biologia della linea melanocitaria. Queste caratteristiche rendono ABCB5 un bersaglio utile per indagare la regolazione, mediata dai trasportatori, dello stato cellulare e della risposta a stressori ambientali o metabolici.

ABCB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCB5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ABCB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCB5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCB5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ABCB5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCB5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ABCB5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ABCB5 nelle cellule tumorali con espressione di ABCB5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.