14-3-3 θ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401384-ACT

YWHAQ kodiert das humane Adapterprotein 14-3-3 Theta, ein Mitglied der 14-3-3-Familie, das an Phosphoserin-/Phosphothreonin-Motive bindet und dadurch die Lokalisation, Stabilität und Aktivität verschiedenster Signalproteine moduliert. Über diese Interaktionen trägt 14-3-3 Theta zur Koordination der Zellzykluskontrolle, von Stressantworten und der apoptotischen Signalübertragung bei und ist in kinasegetriebene Netzwerke wie MAPK/ERK, PI3K-AKT und RAF-assoziierte Signalwege eingebunden. Seine Scaffold-Funktion beeinflusst den Proteintransport und die Zytoskelettdynamik und trägt damit zur Regulation transkriptioneller Programme und der metabolischen Homöostase bei. Dysregulierte 14-3-3-Interaktionen und veränderte YWHAQ-Expression wurden mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und Neurobiologie relevant sind, was den Einsatz in mechanistischen Studien zur Umverdrahtung von Signalwegen und zur zellulären Stressadaptation unterstützt.

14-3-3 θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen YWHAQ-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

14-3-3 θ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des YWHAQ-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der YWHAQ-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 14-3-3 θ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native YWHAQ-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 14-3-3 θ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 14-3-3 θ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem YWHAQ-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.