Plasmide CRISPR d'Activation (h) β′-COP: sc-404144-ACT

COPB2 code β′-COP, une sous-unité essentielle du complexe coatomer (COPI) qui assure le transport vésiculaire rétrograde de l’appareil de Golgi vers le réticulum endoplasmique et participe au trafic intra-Golgi. En reconnaissant des motifs de tri des cargos et en coordonnant l’assemblage du manteau, β′-COP contribue au maintien de l’architecture du Golgi, au recyclage des protéines et à l’homéostasie de la voie de sécrétion. Le trafic dépendant de COPI influence la gestion des lipides, les réponses au stress des organites et la protéostasie, des processus fréquemment perturbés dans le cancer, les maladies neurodégénératives et la biologie des infections. Une activité altérée de COPB2 a été associée à des modifications de la prolifération et de la tolérance au stress cellulaire, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques liés au trafic membranaire.

β′-COP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COPB2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β′-COP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COPB2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COPB2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β′-COP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COPB2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β′-COP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β′-COP dans les cellules tumorales présentant une expression de COPB2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.