Plásmido CRISPR de Activación (h) βB2-crystallin: sc-403626-ACT

CRYBB2 codifica la βB2-cristalina, un componente estructural principal del cristalino del ojo de los vertebrados que contribuye al ensamblaje del complejo de cristalinas, al mantenimiento del índice de refracción y a la transparencia del cristalino a largo plazo. Como proteína de alta expresión y estabilidad inusualmente elevada, la βB2-cristalina favorece la proteostasis de las células de las fibras del cristalino y ayuda a limitar la agregación proteica durante la maduración y el envejecimiento. La alteración de la expresión de CRYBB2 o el mal plegamiento de las cristalinas se asocia con una arquitectura del cristalino alterada y se estudia con frecuencia en el contexto de la formación de cataratas y otros fenotipos de opacificación del cristalino. Dado que las células de las fibras del cristalino son pobres en orgánulos y dependen de redes proteicas duraderas, CRYBB2 sirve como modelo para investigar interacciones con chaperonas, respuestas al estrés redox y la estabilidad proteica en condiciones de alta congestión molecular.

βB2-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CRYBB2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

βB2-crystallin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CRYBB2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CRYBB2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de βB2-crystallin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CRYBB2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de βB2-crystallin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía βB2-crystallin en células tumorales con expresión de CRYBB2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.