βB2-crystallin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403626-ACT

CRYBB2 codifica la βB2-cristallina, una delle principali componenti strutturali del cristallino dei vertebrati, che contribuisce all’assemblaggio del complesso delle cristalline, al mantenimento dell’indice di rifrazione e alla trasparenza del cristallino nel lungo periodo. Proteina altamente espressa e insolitamente stabile, la βB2-cristallina sostiene la proteostasi delle cellule delle fibre del cristallino e aiuta a limitare l’aggregazione proteica durante la maturazione e l’invecchiamento. Un’alterata espressione di CRYBB2 o il ripiegamento scorretto delle cristalline è associato a un’architettura del cristallino compromessa ed è spesso studiato nel contesto della catarattogenesi e di altri fenotipi di opacizzazione del cristallino. Poiché le cellule delle fibre del cristallino sono povere di organelli e dipendono da reti proteiche durevoli, CRYBB2 rappresenta un modello per studiare le interazioni con chaperoni, le risposte allo stress redox e la stabilità proteica in condizioni di elevato affollamento molecolare.

βB2-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CRYBB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

βB2-crystallin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CRYBB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CRYBB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di βB2-crystallin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CRYBB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da βB2-crystallin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via βB2-crystallin nelle cellule tumorali con espressione di CRYBB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.