β8 Tubulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401438-ACT

TUBB8 kodiert β8‑Tubulin, eine primatenspezifische β‑Tubulin‑Isoform, die mit α‑Tubulin zu Heterodimeren zusammentritt und so Mikrotubuli bildet. Diese unterstützen die Organisation des Zytoskeletts, den intrazellulären Transport und die Chromosomentrennung während der Zellteilung. Die Mikrotubuli-Dynamik, die durch die Zusammensetzung der Tubulin-Isoformen reguliert wird, beeinflusst die Spindelassemblierung, die Zellpolarität und Transportwege, die Mitose und frühe Entwicklungsprozesse koordinieren. Beim Menschen sind Varianten in TUBB8 mit Defekten der Integrität der meiotischen Spindel in Oozyten und der frühen embryonalen Entwicklungsfähigkeit assoziiert, wodurch das Gen für Studien zur Reproduktionsbiologie und zur Regulation des Zytoskeletts relevant ist. Ein verändertes Verhalten des Tubulin-Netzwerks ist zudem allgemein aufschlussreich für die Modellierung von Stressantworten, mitotischen Fehlern und mikrotubuliassoziierten Phänotypen in Zellsystemen.

β8 Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBB8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β8 Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBB8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBB8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β8 Tubulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBB8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β8 Tubulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β8 Tubulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBB8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.