α-Syntrophin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404039-ACT

SNTA1 codifica l’α-sintrofin(a), una proteina “scaffold” modulare con dominio PDZ che organizza complessi multiproteici sul versante interno della membrana plasmatica, in particolare all’interno del complesso di glicoproteine associate alla distrofina nel muscolo striato e in domini di membrana specializzati nelle cellule eccitabili. Accoppiando canali ionici, enzimi di segnalazione ed elementi del citoscheletro, l’α-sintrofin(a) influenza la stabilità di membrana, la localizzazione dei canali e i processi di segnalazione a valle che modellano l’eccitabilità cellulare e le risposte allo stress. La funzione di scaffold dipendente da SNTA1 è stata collegata alla regolazione della segnalazione dell’ossido nitrico tramite complessi associati a nNOS e al controllo spaziale di recettori e trasportatori di membrana. La disregolazione o le alterazioni dovute a varianti di SNTA1 sono studiate nel contesto dell’elettrofisiologia cardiaca, della biologia neuromuscolare e dei meccanismi che modificano i microdomini di segnalazione di membrana.

α-Syntrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SNTA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-Syntrophin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SNTA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SNTA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-Syntrophin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SNTA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-Syntrophin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-Syntrophin nelle cellule tumorali con espressione di SNTA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.