Plasmide CRISPR d'Activation (m) αENaC: sc-422825-ACT

Scnn1a code la sous-unité alpha (αENaC) du canal sodique épithélial chez la souris, un composant formant le pore indispensable au transport de Na⁺ sensible à l’amiloride à travers les membranes épithéliales. αENaC contribue à l’absorption apicale de sodium, qui influence l’homéostasie du liquide de surface des voies aériennes, la clairance du liquide alvéolaire et l’équilibre électrolytique transépithélial dans le rein, le poumon et le côlon distal. L’activité du canal est intégrée à la signalisation de l’aldostérone et au contrôle de l’ouverture dépendant des protéases, et elle est modulée par des voies de trafic dépendantes de l’ubiquitine telles que la régulation médiée par NEDD4-2. Une fonction ENaC dérégulée est largement utilisée comme modèle d’altération de la gestion du sel et des fluides, reliant l’expression de Scnn1a à des études sur la déshydratation des voies aériennes, les phénotypes d’obstruction par le mucus et la physiologie liée à la pression artérielle, in vivo et dans des épithéliums cultivés.

αENaC Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Scnn1a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

αENaC Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Scnn1a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Scnn1a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de αENaC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Scnn1a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de αENaC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie αENaC dans les cellules tumorales présentant une expression de Scnn1a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.