α-actinin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430958-ACT

Actn1 codifica per l’α-actinina-1, una proteina legante l’actina insensibile al Ca2+ che reticola la F-actina e ancora le reti del citoscheletro ai complessi di adesione. Nelle cellule murine, l’α-actinina-1 supporta l’organizzazione delle fibre di stress, la maturazione delle adesioni focali e la meccanotrasduzione, influenzando forma cellulare, migrazione e citocinesi. Attraverso interazioni con integrine, vinculina ed effettori di segnalazione a valle delle GTPasi della famiglia Rho, contribuisce al rimodellamento dinamico del citoscheletro di actina e alla rigidità cellulare. Una funzione deregolata di ACTN1 è stata associata a difetti del citoscheletro piastrinico e ad alterazioni dell’architettura tissutale, rendendolo rilevante per lo studio di fenotipi associati al citoscheletro e dei loro driver molecolari.

α-actinin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Actn1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α-actinin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Actn1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Actn1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α-actinin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Actn1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α-actinin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α-actinin-1 nelle cellule tumorali con espressione di Actn1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.