α3d Tubulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400024-ACT

TUBA3D kodiert das menschliche α3d-Tubulin, einen zentralen Bestandteil von Mikrotubuli, der die Architektur des Zytoskeletts, den intrazellulären Transport und den Aufbau des mitotischen Spindelapparats unterstützt. Als Teil des Tubulin-Polymerisationszyklus ermöglichen α/β-Tubulin-Heterodimere die für Zellteilung, Auswachsen neuronaler Fortsätze und polarisierten Transport erforderliche dynamische Instabilität. Der Umbau von Mikrotubuli steht in Wechselwirkung mit Signalwegen, die die Zentrosomenfunktion, die Chromosomentrennung und zilienbezogene Prozesse steuern, und verknüpft damit die Tubulinregulation mit Genomstabilität und Entscheidungen über das Zellschicksal. Fehlregulierte Mikrotubuli-Dynamik und veränderte Muster der Tubulinexpression sind häufig mit proliferativen und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen assoziiert und sind allgemein relevant für Mechanismen, die chromosomaler Instabilität in Krebsmodellen zugrunde liegen.

α3d Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBA3D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

α3d Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBA3D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBA3D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen α3d Tubulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBA3D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von α3d Tubulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des α3d Tubulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBA3D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.