ZUFSP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415124-ACT

Das humane ZUFSP kodiert ein zinkfingerhaltiges deubiquitinierendes Enzym, das die ubiquitinabhängige Proteinkontrolle reguliert, indem es spezifische Ubiquitin-Kettenverknüpfungen spaltet. Es trägt zur Proteostase und zur stressabhängigen Signalübertragung bei, indem es Ubiquitin-Markierungen umgestaltet, die den Proteinabbau, DNA-Schadensantworten und die Homöostase von Organellen steuern. Die ZUFSP-Aktivität greift in die Dynamik des Ubiquitin-Proteasom-Systems ein und kann durch Ubiquitinierung kontrollierte Signalwege beeinflussen, darunter Programme zur Zellzyklusprogression und Genomstabilität. Eine dysregulierte Ubiquitin-Editierung ist breit mit Krebsbiologie und Neurodegeneration verknüpft, wodurch ZUFSP einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Ubiquitin-Signalgebung in menschlichen Zellen darstellt.

ZUFSP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZUFSP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ZUFSP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZUFSP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZUFSP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ZUFSP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZUFSP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ZUFSP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ZUFSP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZUFSP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.