xCT CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424104-ACT

Das murine Slc7a11 kodiert xCT, die leichte Kette des Systems xC⁻, das extrazelluläres Cystin im Austausch gegen intrazelluläres Glutamat importiert und so die intrazelluläre Cystein- und Glutathionsynthese aufrechterhält. Durch die Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts und die Begrenzung der Lipidperoxidation verknüpft xCT den Aminosäuretransport mit Antworten auf oxidativen Stress und der Empfindlichkeit gegenüber Ferroptose. Slc7a11 wird durch stressadaptive Programme einschließlich NRF2 und ATF4 reguliert und steht in mehreren Geweben mit der Glutamat-Homöostase sowie entzündlichen Signalwegen in Wechselwirkung. Eine veränderte xCT-Aktivität wurde in experimentellen Modellen von Neurodegeneration, Immunaktivierung und Tumormetabolismus mit seinen Rollen in der antioxidativen Kapazität und der extrazellulären Glutamatdynamik in Verbindung gebracht.

xCT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc7a11-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

xCT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc7a11-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc7a11-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen xCT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc7a11-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von xCT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des xCT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc7a11-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.