Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS4A: sc-402005-ACT

Le gène humain **VPS4A** code une ATPase AAA+ qui fournit l’énergie nécessaire au désassemblage et au recyclage d’ESCRT-III, rendant possibles les événements de remodelage membranaire requis pour la biogenèse des corps multivésiculaires, le tri du cargo endosomal, l’abscission cytokinétique et la réparation de la membrane plasmique. L’activité de VPS4A se coordonne avec les composants ESCRT pour réguler la diminution des récepteurs, la biogenèse des exosomes et des microvésicules, ainsi que la fermeture de l’enveloppe nucléaire après la mitose. En raison de son rôle central dans le trafic endolysosomal et la fission membranaire, VPS4A est fréquemment étudiée dans des voies influençant la protéostase, la signalisation de l’immunité innée et le bourgeonnement viral, qui détourne la machinerie ESCRT. Une dérégulation des fonctions ESCRT/VPS4 a été associée à des phénotypes neurodégénératifs, à une signalisation altérée des facteurs de croissance et à des modifications du trafic vésiculaire et de la division cellulaire liées au cancer.

VPS4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS4A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS4A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS4A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS4A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS4A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS4A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS4A dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS4A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.