VPS45 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-411599-LAC

VPS45 codifica un regolatore della famiglia Sec1/Munc18 della fusione di membrane dipendente da SNARE, essenziale per il traffico endosomiale e l’ancoraggio (tethering) delle vescicole. Nelle cellule umane, VPS45 sostiene la funzione degli endosomi precoci e le vie di riciclo coordinando gli eventi di docking e fusione delle vescicole, che influenzano il turnover dei recettori, lo smistamento del carico e la segnalazione a valle. L’alterazione di VPS45 perturba il trasporto dagli endosomi alla membrana plasmatica e l’omeostasi endolisosomiale, processi associati a una funzione compromessa delle cellule immunitarie e a una proteostasi alterata. Studi genetici implicano VPS45 in disturbi congeniti caratterizzati da disregolazione immunitaria e infiammazione, evidenziandone la rilevanza per studi meccanicistici del trasporto intracellulare in contesti di malattia.

Le particelle di attivazione lentivirale VPS45 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di VPS45 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale VPS45 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione VPS45, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di VPS45. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo VPS45 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.