VPS35 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402019-ACT

VPS35は、エンドソームからトランスゴルジネットワーク（TGN）への回収輸送および多様なカーゴタンパク質のエンドソームリサイクリングを制御するレトロマー複合体の中核サブユニットをコードしており、これにより膜タンパク質の恒常性とオルガネラの完全性が維持されます。VPS35は、ソーティングネキシンやWASH複合体との相互作用を介して、エンドソームのチューブ形成、アクチンダイナミクス、ならびに輸送経路の調整に寄与し、受容体シグナル伝達、リソソーム機能、オートファジーに影響を与えます。VPS35依存的なソーティングの攪乱はミトコンドリアの品質管理やプロテオスタシスを変化させ得るため、レトロマー機能不全は神経変性など、エンドリソソーム輸送の異常に関連する疾患との結びつきが示唆されます。細胞内輸送経路の中枢的な結節点として、VPS35はヒト細胞モデルにおけるカーゴソーティング、シナプス維持、ストレス応答の機構を検討するために広く用いられています。

VPS35 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性VPS35の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

VPS35 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における VPS35 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はVPS35転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性VPS35の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のVPS35遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるVPS35依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびVPS35発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるVPS35経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。