Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPRBP: sc-403283-ACT

DCAF1 humain, également connu sous le nom de VPRBP, code un récepteur de substrat du complexe ligase E3 d’ubiquitine CUL4–DDB1, qui dirige l’ubiquitination et la dégradation par le protéasome de diverses protéines nucléaires. Par cette fonction d’adaptateur, VPRBP contribue à coordonner l’octroi de licence de la réplication de l’ADN, la régulation de la chromatine, les réponses aux dommages de l’ADN et la progression du cycle cellulaire, reliant la protéostasie médiée par l’ubiquitine au contrôle transcriptionnel. VPRBP a également été impliqué dans des interactions croisées de signalisation avec des kinases ainsi que dans des programmes immunitaires et de réponse au stress via la dégradation régulée de composants de ces voies. La dérégulation de l’ubiquitination dépendante de DCAF1/VPRBP est associée à des altérations de la prolifération et du maintien du génome, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude de la signalisation oncogénique, de la régulation de l’expression génique dépendante de la chromatine et des interactions hôte–pathogène.

VPRBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DCAF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPRBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DCAF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DCAF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPRBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DCAF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPRBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPRBP dans les cellules tumorales présentant une expression de DCAF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.