Plasmide CRISPR d'Activation (h) Visual Arrestin: sc-402997-ACT

SAG code l’arrestine visuelle (arrestine‑1), une protéine régulatrice spécifique des photorécepteurs qui met fin à la signalisation de la rhodopsine en se liant à la rhodopsine activée par la lumière et phosphorylée, et en modulant la phototransduction en aval médiée par la transducine. Cette étape de désensibilisation est essentielle aux cinétiques de récupération, à la fidélité du signal et à la protection des bâtonnets contre une activation excessive des voies GPCR. L’arrestine visuelle contribue aussi au trafic des récepteurs et à l’équilibre de la signalisation dans le segment externe, en s’intégrant aux cycles de phosphorylation de la rhodopsine pilotés par GRK1. Une dérégulation ou des variations pathogènes de SAG sont associées à des dysfonctionnements rétiniens héréditaires, ce qui en fait une cible clé pour les études mécanistiques du stress des photorécepteurs, des voies de dégénérescence et de la transduction du signal visuel.

Visual Arrestin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SAG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Visual Arrestin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SAG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SAG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Visual Arrestin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SAG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Visual Arrestin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Visual Arrestin dans les cellules tumorales présentant une expression de SAG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.