Plasmide CRISPR d'Activation (m) VDUP1: sc-425098-ACT

Txnip code VDUP1 (thioredoxin-interacting protein), un régulateur sensible à l’état rédox qui se lie à la thioredoxine afin de moduler les réponses cellulaires au stress oxydant et l’homéostasie des thiols. Dans les cellules de souris, VDUP1 relie les signaux métaboliques à des programmes de signalisation incluant la détection de l’état énergétique liée à l’AMPK, l’utilisation du glucose et des sorties transcriptionnelles inflammatoires, influençant l’apoptose, l’autophagie et le contrôle du cycle cellulaire. L’expression de Txnip répond au stress nutritionnel et aux ROS (espèces réactives de l’oxygène), ce qui le place à l’interface entre la fonction mitochondriale et les voies d’adaptation au stress. Une activité dérégulée de TXNIP/VDUP1 a été associée à des mécanismes de maladies métaboliques et inflammatoires, ce qui en fait un nœud utile pour étudier le couplage rédox–métabolisme en recherche biomédicale.

VDUP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Txnip sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VDUP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Txnip dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Txnip, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VDUP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Txnip natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VDUP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VDUP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Txnip silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.