Plásmido CRISPR de Activación (h) VAChT: sc-401240-ACT

SLC18A3 codifica el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), una proteína de la membrana de las vesículas sinápticas que empaqueta la acetilcolina citosólica en vesículas secretoras en neuronas colinérgicas y otros tipos celulares colinérgicos. Al proporcionar acetilcolina vesicular para la exocitosis regulada, VAChT es esencial para la transmisión sináptica en la unión neuromuscular y en todo el sistema nervioso autónomo y central, influyendo en el acoplamiento excitación–contracción y en la actividad de los circuitos neuronales. La función de VAChT está estrechamente vinculada al metabolismo de la acetilcolina y a las vías de reciclaje de vesículas, incluida la coordinación con la síntesis dependiente de la colina acetiltransferasa y con la maquinaria de tráfico vesicular. La señalización colinérgica alterada y la liberación desregulada de acetilcolina están implicadas en múltiples contextos de la neurobiología, lo que convierte a SLC18A3 en un objetivo útil para estudiar los mecanismos que subyacen a la disfunción colinérgica en modelos relevantes de enfermedad.

VAChT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC18A3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VAChT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC18A3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC18A3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VAChT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC18A3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VAChT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VAChT en células tumorales con expresión de SLC18A3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.