V-ATPase D CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403291-ACT

ATP6V1D kodiert die D‑Untereinheit der vakuolären H+-ATPase (V‑ATPase) des V1‑Domänes, einer rotierenden ATPase, die die Hydrolyse von ATP mit dem Protonentransport über intrazelluläre Membranen koppelt. Durch die Unterstützung der Ansäuerung von Organellen trägt die V‑ATPase‑D‑Untereinheit zur Reifung des Endosom‑Lysosom‑Systems, zum autophagischen Flux, zum Rezeptor‑Recycling sowie zum pH‑abhängigen Transport durch sekretorische und endozytotische Wege bei. Die pH‑Regulation durch die V‑ATPase beeinflusst zudem die Nährstoffsensorik, einschließlich der mTORC1‑Signalgebung an der Lysosomenoberfläche, und prägt die Aktivität von Proteasen in sauren Kompartimenten. Eine Fehlregulation der V‑ATPase‑Funktion und der vesikulären Ansäuerung wurde mit veränderter Proteostase, neurodegenerativen Prozessen sowie krebsassoziierten metabolischen und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, was ATP6V1D zu einem hilfreichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der zellulären Homöostase macht.

V-ATPase D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V1D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V1D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V1D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase D-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V1D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase D-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase D-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V1D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.