V-ATPase α1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403882-ACT

ATP6V1A kodiert die V-ATPase‑Untereinheit α1, einen Kernbestandteil des zytosolischen V1‑Sektors, der die ATP‑Hydrolyse mit der Protonentranslokation durch den vakuolären H⁺‑ATPase‑Komplex koppelt. Dieses Enzym säuert Endosomen, Lysosomen und sekretorische Vesikel an und unterstützt damit die rezeptorvermittelte Endozytose, den autophagischen Flux, den Membrantransport (Trafficking) und die Proteinprozessierung; in spezialisierten Kontexten trägt es außerdem zur pH‑Homöostase an der Plasmamembran bei. Durch die Kontrolle der Organellenansäuerung beeinflusst die V‑ATPase‑Aktivität Nährstoffsensorik und Signalprogramme, einschließlich Signalwege, die mit der Regulation von mTORC1 und der Vesikelreifung verknüpft sind. Eine dysregulierte vakuoläre Ansäuerung und eine veränderte ATP6V1A‑Funktion wurden mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Neurobiologie, Krebszellbiologie und Wirt‑Pathogen‑Interaktionen relevant sind, was ATP6V1A zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der Proteostase und des intrazellulären Transports macht.

V-ATPase α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase α1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase α1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase α1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.