Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase A2: sc-406000-ACT

ATP6V0A2 code l’isoforme a2 de la sous-unité a du domaine V0 de l’ATPase vacuolaire à protons (V-ATPase), une pompe à protons multisous-unités qui acidifie les endosomes, les lysosomes et les compartiments sécrétoires. En régulant le pH des organites, V-ATPase A2 soutient l’endocytose médiée par les récepteurs, le trafic vésiculaire, la maturation des protéines et les voies de dégradation dépendantes des lysosomes qui influencent l’homéostasie cellulaire. L’activité d’ATP6V0A2 a également un impact sur l’assemblage de la matrice extracellulaire et sur des processus sécrétoires associés à la glycosylation, établissant un lien entre l’acidification des compartiments et l’organisation tissulaire. La perturbation ou la dérégulation d’ATP6V0A2 a été associée à des troubles congénitaux affectant l’intégrité du tissu conjonctif et la glycosylation, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du contrôle du pH intracellulaire et de la biologie des voies sécrétoires.

V-ATPase A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V0A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase A2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V0A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V0A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase A2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V0A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase A2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase A2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V0A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.