Plasmide CRISPR d'Activation (h) USP47: sc-403157-ACT

USP47 code une protéase humaine spécifique de l’ubiquitine qui inverse l’ubiquitination afin de réguler la stabilité des protéines, leur localisation subcellulaire et l’intensité de la signalisation. Par la désubiquitination de substrats clés, USP47 a été associée au contrôle des réponses aux dommages de l’ADN, de la progression du cycle cellulaire et de voies d’adaptation au stress qui façonnent la protéostase et le maintien du génome. Une activité altérée de l’USP47 peut modifier le renouvellement dépendant de l’ubiquitine et la signalisation des points de contrôle, des processus souvent perturbés en biologie du cancer et dans d’autres troubles impliquant un contrôle défectueux de la qualité des protéines. Par conséquent, USP47 est fréquemment étudiée dans des contextes où la régulation médiée par l’ubiquitine influence la fitness cellulaire, l’intégrité de la réplication et les programmes transcriptionnels.

USP47 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de USP47 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

USP47 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus USP47 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription USP47, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de USP47. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus USP47 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de USP47 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie USP47 dans les cellules tumorales présentant une expression de USP47 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.