Plasmide CRISPR d'Activation (m2) USP45: sc-429548-ACT-2

Chez la souris, le gène Usp45 code l’USP45, une protéase spécifique de l’ubiquitine qui enlève les modifications d’ubiquitination des protéines cibles afin de réguler leur stabilité et leur signalisation. USP45 est impliquée dans la réponse aux dommages de l’ADN, en favorisant le maintien du génome grâce à des événements de désubiquitination qui influencent le choix des voies de réparation et la tolérance au stress de réplication, notamment via une coordination avec des réseaux de modifications post-traductionnelles tels que les signalisations ubiquitine et SUMO. La perturbation de la désubiquitination médiée par USP45 peut dérégler les processus de réparation associés à la chromatine, accroître l’instabilité génomique et a été associée à des phénotypes pertinents pour la biologie du cancer ainsi qu’à des anomalies du développement. Les approches d’édition génique ciblant Usp45 et les études de génomique fonctionnelle dans des cellules de souris permettent de disséquer les mécanismes des circuits de réparation de l’ADN dépendants de l’ubiquitine, d’identifier les substrats et partenaires d’interaction d’USP45, et de modéliser les relations génotype–phénotype au sein des voies de l’intégrité du génome.

USP45 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Usp45 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

USP45 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Usp45 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Usp45, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de USP45. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Usp45 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de USP45 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie USP45 dans les cellules tumorales présentant une expression de Usp45 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.