Plasmide CRISPR d'Activation (m) USP32: sc-433591-ACT

Usp32 code l’enzyme déubiquitinante USP32, une protéase spécifique de l’ubiquitine qui inverse la conjugaison de l’ubiquitine afin de réguler la stabilité des protéines, leur trafic intracellulaire et la transduction des signaux. Dans le cadre du contrôle qualité dépendant de l’ubiquitine, USP32 participe au contrôle de la protéostasie et du renouvellement des composants de voies qui influencent la progression du cycle cellulaire, les réponses au stress et la signalisation associée aux membranes. Une déubiquitination dérégulée présente une importance majeure en oncologie et en neurobiologie, en modifiant la dégradation de protéines régulatrices et en altérant les sorties des voies de signalisation. Dans des systèmes modèles murins, la modulation de l’activité de USP32 permet des études mécanistiques des réseaux de signalisation de l’ubiquitine et de leurs rôles dans des phénotypes cellulaires associés aux maladies.

USP32 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Usp32 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

USP32 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Usp32 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Usp32, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de USP32. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Usp32 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de USP32 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie USP32 dans les cellules tumorales présentant une expression de Usp32 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.