Plasmide CRISPR d'Activation (h) USP20: sc-406849-ACT

USP20 humain code une enzyme de déubiquitination (protéase spécifique de l’ubiquitine 20) qui retire les chaînes d’ubiquitine des protéines substrats afin de moduler leur stabilité, leur localisation et leur sortie de signalisation. En régulant la dégradation dépendante de l’ubiquitine, USP20 influence des processus tels que le trafic des récepteurs, la transduction des signaux inflammatoires et les voies de réponse au stress qui déterminent la croissance et la survie cellulaires. Des altérations de la dynamique de déubiquitination impliquant USP20 ont été associées dans la littérature à une dérégulation de réseaux de signalisation pertinents pour la transformation oncogénique, la régulation immunitaire et les dysfonctionnements métaboliques, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de la protéostasie. L’analyse du rôle d’USP20 peut donc aider à préciser comment l’édition de l’ubiquitine ajuste l’amplitude et la durée des voies de signalisation dans les cellules humaines.

USP20 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de USP20 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

USP20 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus USP20 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription USP20, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de USP20. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus USP20 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de USP20 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie USP20 dans les cellules tumorales présentant une expression de USP20 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.