Plasmide CRISPR d'Activation (h) ULK1: sc-400516-ACT

ULK1 (UNC-51-like autophagy activating kinase 1) est une kinase sérine/thréonine qui initie la macroautophagie en intégrant les signaux nutritifs et énergétiques. Elle agit au cœur du complexe ULK1 pour favoriser la formation du phagophore et coordonne en aval la machinerie de l’autophagie en réponse à l’inhibition de mTORC1 et à l’activation d’AMPK. En régulant le flux autophagique, ULK1 influence l’homéostasie mitochondriale, la protéostasie et l’adaptation cellulaire au stress métabolique. Une signalisation ULK1 dérégulée et un contrôle altéré de l’autophagie sont impliqués dans des contextes tels que la neurodégénérescence, la biologie des infections et les réponses au stress des cellules cancéreuses, où une capacité catabolique modifiée peut remodeler les voies de survie.

ULK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ULK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ULK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ULK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ULK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ULK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ULK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ULK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ULK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ULK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.