Plasmide CRISPR d'Activation (h) UKHC: sc-402349-ACT

KIF5B code la chaîne lourde de la kinésine‑1, l’isoforme UKHC, un moteur associé aux microtubules qui assure, de façon ATP‑dépendante, le transport antérograde de vésicules, de complexes protéiques et d’organites dans les cellules polarisées. En coordination avec les chaînes légères de la kinésine et des adaptateurs de cargaison, KIF5B soutient le trafic intracellulaire, la dynamique du centrosome et du fuseau mitotique, ainsi que l’organisation du cytosquelette, influençant ainsi des processus tels que la mitose, la sécrétion et le transport neuronal. Une activité ou une expression dérégulée de KIF5B peut perturber la distribution des organites et la signalisation, et KIF5B est fréquemment étudié dans le contexte de fusions géniques oncogéniques (p. ex., KIF5B‑RET) et de voies de prolifération altérées. Ces caractéristiques font de KIF5B un nœud pertinent pour explorer les mécanismes de transport sur microtubules, le contrôle du cycle cellulaire et la signalisation dépendante du trafic dans des modèles cellulaires humains.

UKHC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KIF5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UKHC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KIF5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KIF5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UKHC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KIF5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UKHC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UKHC dans les cellules tumorales présentant une expression de KIF5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.