Plásmido CRISPR de Activación (h) UKHC: sc-402349-ACT

KIF5B codifica la isoforma UKHC de la cadena pesada de kinesina-1, un motor basado en microtúbulos que impulsa el transporte anterógrado dependiente de ATP de vesículas, complejos proteicos y orgánulos en células polarizadas. Mediante su coordinación con las cadenas ligeras de kinesina y adaptadores de carga, KIF5B favorece el tráfico intracelular, la dinámica del centrosoma y del huso mitótico, y la organización del citoesqueleto, influyendo así en procesos como la mitosis, la secreción y el transporte neuronal. La actividad o expresión desregulada de KIF5B puede alterar la distribución de orgánulos y la señalización, y KIF5B se estudia con frecuencia en el contexto de fusiones génicas oncogénicas (p. ej., KIF5B-RET) y de vías proliferativas alteradas. Estas características hacen de KIF5B un nodo útil para investigar mecanismos de transporte por microtúbulos, el control del ciclo celular y la señalización dependiente del tráfico en modelos de células humanas.

UKHC El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KIF5B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UKHC El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KIF5B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KIF5B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UKHC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KIF5B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UKHC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UKHC en células tumorales con expresión de KIF5B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.