Plásmido CRISPR de Activación (h) UCH-L1: sc-401088-ACT

UCHL1 codifica la hidrolasa de ubiquitina C-terminal L1 (UCH-L1), una enzima desubiquitinante enriquecida en neuronas que regula la homeostasis de la ubiquitina y la proteostasis mediante el procesamiento de precursores de ubiquitina y el reciclaje de ubiquitina a partir de sustratos conjugados. A través de sus funciones en el sistema ubiquitina–proteasoma y en el control de calidad proteico, UCH-L1 influye en la función sináptica, la integridad axonal y las respuestas celulares al estrés proteotóxico. La expresión o actividad alteradas de UCHL1 se han asociado con procesos neurodegenerativos, incluidas vías vinculadas a la agregación de proteínas y a la vulnerabilidad neuronal, y también se estudia en contextos de biología tumoral y regulación del estado celular. Estas características hacen de UCHL1 una diana útil para investigar la señalización dependiente de ubiquitina, la diferenciación neuronal y los fenotipos de respuesta al estrés en sistemas modelo humanos.

UCH-L1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UCHL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UCH-L1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UCHL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UCHL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UCH-L1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UCHL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UCH-L1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UCH-L1 en células tumorales con expresión de UCHL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.