UBC13 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417204-ACT

Das humane UBE2N-Gen kodiert das E2-Ubiquitin-konjugierende Enzym UBC13, einen zentralen Katalysator der Lys63-verknüpften Polyubiquitinierung, die nicht-proteolytische Signalantworten steuert. Im Komplex mit UEV-Kofaktoren wie UBE2V1/UBE2V2 unterstützt UBC13 die Bildung von K63-Ubiquitin-Ketten, die DNA-Schadensantworten, die Toleranz gegenüber Replikationsstress und die angeborene Immunsignalgebung koordinieren. Diese Aktivität ist entscheidend für die Aktivierung von Signalwegen wie NF-κB und MAPK nachgeschaltet von Rezeptoren wie TNFR und Toll-like-Rezeptoren und beeinflusst dabei eher die Dynamik von Proteinkomplexen als den proteasomalen Abbau. Eine fehlregulierte, UBE2N/UBC13-abhängige Ubiquitin-Signalgebung wurde mit veränderten Entzündungszuständen, Defekten der Genomstabilität und einer Umprogrammierung onkogener Signalwege in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und Immunologie.

UBC13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2N-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBC13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2N-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2N-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBC13-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2N-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBC13-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBC13-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2N-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.