Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBC13: sc-417204-ACT

Le gène humain UBE2N code l’enzyme E2 de conjugaison de l’ubiquitine UBC13, un catalyseur central de la polyubiquitination liée à la Lys63, qui façonne des sorties de signalisation non protéolytiques. En complexe avec des cofacteurs UEV tels qu’UBE2V1/UBE2V2, UBC13 favorise l’assemblage de chaînes d’ubiquitine K63 qui coordonnent les réponses aux dommages de l’ADN, la tolérance au stress de réplication et la signalisation de l’immunité innée. Cette activité est essentielle à l’activation de voies telles que NF-κB et MAPK en aval de récepteurs comme TNFR et les récepteurs de type Toll, et elle influence la dynamique des complexes protéiques plutôt que la dégradation par le protéasome. Une signalisation ubiquitine dépendante d’UBE2N/UBC13 dérégulée a été impliquée dans des états inflammatoires altérés, des défauts de stabilité du génome et une reprogrammation de voies oncogéniques, ce qui la rend pertinente pour des études mécanistiques en biologie du cancer et en immunologie.

UBC13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2N sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBC13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2N dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2N, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBC13. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2N natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBC13 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBC13 dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2N silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.