U2AF35 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404986-ACT

Das humane U2AF1 kodiert U2AF35, eine zentrale Komponente des U2-auxiliären Spleißfaktors, der die 3′-Spleißstelle erkennt und während der Assemblierung des Spleißosoms die Rekrutierung des U2-snRNP unterstützt. Durch die Partnerschaft mit U2AF2 (U2AF65) und die Interaktion mit Polypyrimidin-Trakten sowie Merkmalen von Spleißjunctions trägt U2AF35 zu Entscheidungen der alternativen Spleißung bei, die das Spektrum der mRNA-Isoformen, die Transkriptstabilität und die Proteindiversität prägen. U2AF1-abhängige Spleißprogramme überschneiden sich mit der RNA-Prozessierung, der Kopplung an die Transkription und der Zellzyklus-Kontrolle und machen U2AF1 zu einem wichtigen Knotenpunkt der posttranskriptionellen Genregulation. Wiederkehrende U2AF1-Veränderungen und dysregulierte Spleißsignaturen sind mit der Biologie hämatologischer Malignome sowie allgemeineren Störungen der RNA-Spleißwege assoziiert, was seinen Einsatz in mechanistischen Studien zur Funktion des Spleißosoms und zu krankheitsrelevanten Spleißveränderungen unterstützt.

U2AF35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen U2AF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

U2AF35 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des U2AF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der U2AF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen U2AF35-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native U2AF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von U2AF35-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des U2AF35-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem U2AF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.