Plasmide CRISPR d'Activation (h) Type II 4-phosphatase: sc-402205-ACT

INPP4B code la 4‑phosphatase des inositol polyphosphates de type II B, une phosphatase lipidique qui hydrolyse le phosphatidylinositol 3,4‑bisphosphate en phosphatidylinositol 3‑phosphate, modulant ainsi la composition des phosphoinositides au niveau des membranes cellulaires. Par cette activité, INPP4B influence la transduction du signal PI3K/AKT, le trafic endosomal et les processus associés au cytosquelette qui contrôlent la prolifération, la survie et la migration. Une expression altérée d’INPP4B ou le contexte de la voie a été associé à une dérégulation de la signalisation des phosphoinositides dans plusieurs situations pertinentes pour les maladies, notamment en biologie du cancer et dans la signalisation métabolique. En tant que régulateur de nœuds de signalisation proches de la membrane, INPP4B est fréquemment étudiée pour ses effets sur l’amplitude des voies, le contrôle par rétroaction et les transitions d’état cellulaire.

Type II 4-phosphatase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de INPP4B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Type II 4-phosphatase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus INPP4B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription INPP4B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Type II 4-phosphatase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus INPP4B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Type II 4-phosphatase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Type II 4-phosphatase dans les cellules tumorales présentant une expression de INPP4B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.