Plasmide CRISPR d'Activation (h) tuberin: sc-400683-ACT

Le gène humain **TSC2** code la tubérine, un suppresseur de tumeur qui forme avec l’hamartine (TSC1) un complexe fonctionnel agissant comme une GAP pour RHEB et limitant la signalisation de mTORC1. En intégrant des signaux issus des voies PI3K–AKT, AMPK et MAPK, la tubérine coordonne la détection des nutriments, la synthèse protéique, l’autophagie et le contrôle de la croissance cellulaire. La perte ou l’atténuation de la fonction de TSC2 perturbe les programmes métaboliques et traductionnels dépendants de mTOR et modifie la dynamique de signalisation associée aux lysosomes. La dérégulation de l’axe TSC1/TSC2–RHEB–mTOR est étroitement liée à la sclérose tubéreuse de Bourneville et à des mTORopathies apparentées, constituant un cadre central pour les études mécanistiques du contrôle de la croissance et de l’homéostasie cellulaire.

tuberin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TSC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

tuberin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TSC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TSC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de tuberin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TSC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de tuberin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie tuberin dans les cellules tumorales présentant une expression de TSC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.