Plasmide CRISPR d'Activation (h) TTP: sc-400722-ACT

Le gène humain ZFP36 code la tristetraproline (TTP), une protéine liant l’ARN qui reconnaît des éléments riches en AU dans la région 3′ non traduite (3′ UTR) des transcrits cibles et favorise leur déadénylation et leur dégradation. Par un contrôle post-transcriptionnel, TTP limite l’expression des cytokines et des gènes de réponse immédiate et façonne les programmes inflammatoires et de réponse au stress, notamment les voies de signalisation pilotées par TNF/NF-κB. L’activité de TTP est régulée de manière dynamique par phosphorylation en aval des voies MAPK, ce qui influence le renouvellement des ARNm, la traduction et la dynamique des granules de ribonucléoprotéines. Une expression ou une fonction dérégulée de ZFP36/TTP a été associée à une activation immunitaire aberrante, à des phénotypes inflammatoires chroniques et à des réseaux de cytokines associés aux tumeurs altérés, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la biologie des maladies liées à l’inflammation.

TTP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ZFP36 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TTP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ZFP36 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ZFP36, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TTP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ZFP36 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TTP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TTP dans les cellules tumorales présentant une expression de ZFP36 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.