TTC36 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414529-ACT

Das humane TTC36 kodiert ein Tetratricopeptid-Repeat-(TPR)-haltiges Protein, das voraussichtlich als Gerüst für Protein-Protein-Interaktionen wirkt und die Assemblierung oder Stabilität von Multiproteinkomplexen modulieren kann. TPR-Proteine beeinflussen häufig intrazelluläre Signalwege, Proteintransport und Qualitätskontrollmechanismen, indem sie Chaperon-Interaktionen und die subzelluläre Lokalisation koordinieren. Obwohl TTC36 bislang relativ wenig untersucht ist, machen sein Expressionsmuster und potenzielle Interaktionsnetzwerke es relevant für die Untersuchung kontextabhängiger Regulation von Transkriptionsprogrammen und der Proteostase in menschlichen Zellen. Veränderte Aktivität TPR-assoziierter Gerüstbildungsprozesse wurde allgemein mit gestörter Wachstumsregulation und Stressantworten in Verbindung gebracht, was TTC36 zu einem geeigneten Ziel für explorative Forschung zu Krankheitsmechanismen macht.

TTC36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TTC36-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TTC36 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TTC36-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TTC36-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TTC36-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TTC36-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TTC36-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TTC36-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TTC36-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.