Troponin T-SS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402749-ACT

TNNT1 kodiert das langsame Skelettmuskel-Troponin T (Troponin T-SS), einen zentralen Bestandteil des Troponin-Komplexes, der regulatorische Untereinheiten an Tropomyosin im dünnen Filament verankert und Ca²⁺-abhängige Aktin-Myosin-Interaktionen fein abstimmt. Durch die Kopplung der Kalziumsignalgebung an die Kontraktionsmechanik des Sarkomers beeinflusst TNNT1 die Myofibrillenassemblierung, die Erzeugung kontraktiler Kraft und die faser­typspezifische Muskelphysiologie. Eine veränderte TNNT1-Expression oder -Funktion steht mit Störungen der Skelettmuskulatur in Zusammenhang und wurde mit Phänotypen angeborener neuromuskulärer Erkrankungen assoziiert, was TNNT1 für Studien zur sarkomerischen Regulation, Muskelentwicklung und zu kontraktilitätsassoziierten Stressantworten relevant macht. TNNT1 wird daher häufig als Marker und mechanistischer Knotenpunkt in Signalwegen genutzt, die die Erregungs-Kontraktions-Kopplung und die Integrität von Muskelfasern steuern.

Troponin T-SS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNNT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Troponin T-SS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNNT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNNT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Troponin T-SS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNNT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Troponin T-SS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Troponin T-SS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNNT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.