Plasmide CRISPR d'Activation (h) Troponin T-FS: sc-402885-ACT

TNNT3 code la troponine T du muscle squelettique rapide (Troponine T‑FS), un composant central du complexe de la troponine qui ancre la tropomyosine sur le filament fin et couple la liaison du Ca²⁺ au cycle régulé des ponts actine–myosine. En intégrant la signalisation calcique à la mécanique du sarcomère, la troponine T‑FS contribue à déterminer la cinétique de contraction, la génération de force et les propriétés contractiles spécifiques des types de fibres. L’activité de TNNT3 s’inscrit à l’interface du couplage excitation–contraction et des voies d’assemblage myofibrillaire qui façonnent la performance musculaire et l’intégrité structurale. Une dérégulation ou des variations des composants de la troponine rapide ont été associées à une contractilité altérée et à des phénotypes myopathiques, faisant de TNNT3 un point d’entrée utile pour étudier la biologie du muscle squelettique et le remodelage contractile lié aux maladies.

Troponin T-FS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TNNT3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Troponin T-FS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TNNT3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TNNT3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Troponin T-FS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TNNT3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Troponin T-FS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Troponin T-FS dans les cellules tumorales présentant une expression de TNNT3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.