Troponin I-SS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403502-ACT

TNNI1 kodiert Troponin I-SS, eine Troponin-I-Isoform der quergestreiften Muskulatur, die als inhibitorische Untereinheit des Troponin-Komplexes fungiert und die Aktin–Myosin-Interaktion Ca2+-abhängig reguliert. Durch die Modulation der Aktivierung der dünnen Filamente und der Sarkomer-Kontraktilität trägt Troponin I-SS zur Erregungs-Kontraktions-Kopplung und zur Leistungsfähigkeit von Muskelfasern während der Entwicklung sowie in spezialisierten Muskelkontexten bei. Die Expression von TNNI1 und das Isoform-Gleichgewicht überschneiden sich mit Signalwegen, die die Myofibrillogenese, die Kalziumsignalisierung und den Umbau des kontraktilen Apparats steuern. Eine veränderte Troponin-Zusammensetzung und eine dysregulierte sarkomerische Regulation sind relevant für Studien zu Myopathien und kardiomyopathieassoziierten Phänotypen sowie für Modellsysteme, die Muskeldifferenzierung und Stressantworten untersuchen.

Troponin I-SS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNNI1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Troponin I-SS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNNI1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNNI1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Troponin I-SS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNNI1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Troponin I-SS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Troponin I-SS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNNI1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.