Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRIM5α: sc-409348-ACT

TRIM5α (tripartite motif-containing 5 alpha) est un facteur de restriction inductible par l’interféron qui reconnaît les capsides rétrovirales et bloque l’infection via un décapsidage prématuré, suivi d’une inhibition en aval de la transcription inverse. En tant que ligase E3 de l’ubiquitine dotée d’une architecture RING–B-box–hélice enroulée (coiled-coil) et d’un domaine PRY/SPRY se liant à la capside, TRIM5α couple la reconnaissance de motifs à une signalisation dépendante de l’ubiquitine et à la protéostasie, en s’articulant avec des voies de l’immunité innée telles que NF-κB et les réponses en cytokines inflammatoires. Les variations de TRIM5 influencent le spectre d’hôtes et la sensibilité aux rétrovirus, ce qui en fait une cible largement étudiée dans la défense antivirale, la régulation immunitaire et la coévolution hôte–pathogène. Une détection innée dérégulée et une signalisation ubiquitine impliquant des protéines de la famille TRIM sont également pertinentes pour les pathologies à médiation immunitaire et les réponses au stress cellulaire.

TRIM5α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIM5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRIM5α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIM5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIM5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRIM5α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIM5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRIM5α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRIM5α dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIM5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.