Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRIM35: sc-405277-ACT

TRIM35 code une ligase E3 d’ubiquitine de la famille « tripartite motif » (TRIM), impliquée dans la régulation du renouvellement des protéines et de la signalisation de l’immunité innée. Grâce à son architecture RING/B-box/domaine en hélice enroulée (coiled-coil), TRIM35 peut influencer des processus dépendants de l’ubiquitine qui façonnent les réponses antivirales, la signalisation au stress et le maintien de l’homéostasie cellulaire. Une expression altérée de TRIM35 ou une dérégulation des voies d’ubiquitination ont été associées à des phénotypes pertinents pour l’inflammation et la biologie du cancer, faisant de TRIM35 un nœud utile pour des études mécanistiques de la fidélité des voies de signalisation. Dans des modèles cellulaires humains, TRIM35 est souvent étudiée pour sa contribution au dialogue (crosstalk) entre la surveillance immunitaire et le contrôle de la croissance.

TRIM35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIM35 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRIM35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIM35 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIM35, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRIM35. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIM35 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRIM35 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRIM35 dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIM35 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.