Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRIM32: sc-402731-ACT

TRIM32 code une ligase E3 de l’ubiquitine appartenant à la famille TRIM, qui régule l’homéostasie des protéines en catalysant l’ubiquitination de ses substrats et en coordonnant leur dégradation par le protéasome. Grâce à ses domaines RING, B-box, coiled-coil et à ses répétitions NHL, TRIM32 influence la différenciation myogénique, l’organisation du cytosquelette et la signalisation en réponse au stress, avec des liens rapportés avec des voies telles que NF-κB et le contrôle qualité associé à l’autophagie. En biologie humaine, une altération de la fonction de TRIM32 est associée à des phénotypes neuromusculaires, notamment la dystrophie musculaire des ceintures et certaines myopathies congénitales, et une expression dérégulée a été étudiée dans des contextes liés aux tumeurs, où la protéostasie et les programmes transcriptionnels sont remodelés. Ces caractéristiques font de TRIM32 un nœud utile pour disséquer la régulation dépendante de l’ubiquitine, les transitions d’état des cellules musculaires et les relations génotype–phénotype dans des modèles cellulaires.

TRIM32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TRIM32 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRIM32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TRIM32 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TRIM32, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRIM32. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TRIM32 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRIM32 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRIM32 dans les cellules tumorales présentant une expression de TRIM32 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.