Plasmide CRISPR d'Activation (m) TREK-1: sc-421244-ACT

Le gène murin *Kcnk2* code TREK-1, un canal potassique (K2P) mécanosensible à deux pores qui fournit une conductance de fond au K+ afin de stabiliser le potentiel de membrane au repos et d’ajuster l’excitabilité neuronale et gliale. TREK-1 intègre des signaux issus de l’étirement membranaire, de la température, du pH intracellulaire et de médiateurs lipidiques, reliant ainsi des indices biophysiques à des modifications de la polarisation membranaire, ce qui façonne la décharge des potentiels d’action et la transmission synaptique. Par son rôle dans le maintien de l’homéostasie ionique, TREK-1 influence des processus tels que la neuroprotection, le traitement des signaux douloureux et l’activité de circuits sensibles au stress. Des altérations de la fonction Kcnk2/TREK-1 ont été étudiées dans le cadre de phénotypes neurologiques et neuropsychiatriques, ce qui en fait une cible pertinente pour l’exploration mécanistique de voies dans des systèmes de modèles murins.

TREK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Kcnk2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TREK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Kcnk2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Kcnk2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TREK-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Kcnk2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TREK-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TREK-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Kcnk2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.