Treacle Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403067-ACT

O TCOF1 humano codifica a treacle, uma fosfoproteína nucleolar essencial para a biogénese dos ribossomas e para o desenvolvimento da crista neural. A treacle participa na transcrição de rDNA e no processamento do pré-rRNA e coordena respostas ao stress nucleolar por meio de interações com fatores associados à RNA polimerase I. A disrupção de TCOF1 perturba a homeostase nucleolar, afeta a sinalização de stress ligada ao p53 e altera programas de proliferação e diferenciação. Variantes patogénicas em TCOF1 estão associadas à síndrome de Treacher Collins, tornando a regulação de TCOF1 relevante para estudos do desenvolvimento craniofacial e de ribossomopatias.

Treacle O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TCOF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Treacle O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TCOF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TCOF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Treacle. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TCOF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Treacle no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Treacle em células tumorais com expressão de TCOF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.